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浙江工商人学硕士研究扛学位论文保存。小结在阿维拉霉素高产菌株

归档日期:07-23       文本归类:德萨盖纳迪奥普      文章编辑:爱尚语录

  浙江工商人学硕士研究扛学位论文保存。小结在阿维拉霉素高产菌株的选育过程中 根据阿维拉霉素的生物合成和代谢调节机理 通过一次钴 放射性诱变、四次 诱变分别进行阿维拉霉素、链霉素、 一脱氧 葡萄搪 氨基丁酸抗性菌株的筛选获得比出发菌株 产量提高了的突变株 。该菌株能部分解除抗生素自身代谢终产物的反馈抑制

  浙江工商人学硕士研究扛学位论文保存。小结在阿维拉霉素高产菌株的选育过程中 根据阿维拉霉素的生物合成和代谢调节机理 通过一次钴 放射性诱变、四次 诱变分别进行阿维拉霉素、链霉素、 一脱氧 葡萄搪 氨基丁酸抗性菌株的筛选获得比出发菌株 产量提高了的突变株 。该菌株能部分解除抗生素自身代谢终产物的反馈抑制作用 部分解除缬氨酸对缬氨酸生物合成的反馈抑制作用 和解除碳源分解代谢物阻遏作用 生产能力较高 传代稳定性好 其摇瓶发酵产量达到 。菌株 的推理选育系谱见图 菌株的推理选育系谱 浙江工商大学硕上研究学位论文第五章阿维拉霉素发酵培养基优化和发酵条件的研究引言菌株的高产特性不仅由其遗传特性决定 而且也由其所处的环境条件决定。发酵法生产抗生素产量的高低除了受生产菌种的影响外 培养基的组成和培养条件对产量的影响也很大。抗生素发酵水平的提高 主要依赖于菌种选育及发酵工艺 培养基和培养条件 的优化 这两个环节是相辅相成的。菌种选育就是按照生产要求 根据微生物的遗传和变异的理论 用人工的方法造成菌种变异 再经过筛选获得高产变株而达到提高发酵水平的目 而发酵工艺的优化是改变培养基的组成及在发酵过程中改变培养温度、通气量、搅拌转速、调节 、补料、补水、加入前体等措施 从而强化微生物的生物合成的全过程 提高发酵产量。通过工艺优化 改进发酵培养基成份和发酵条件 创造适合菌体生长和生物代谢的最佳条件 充分发挥菌种的生产潜力 从而显著提高发酵产量。本章对阿维拉霉素发酵培养基和培养条件进行了优化 找到一条适合该菌种发酵的生产工艺 以进一步提高阿维拉霉素的生产水平。第一节材料与方法阿维拉霉素产生菌株 见第二章材料与方法第二节结果与讨论一、阿维拉霉素产生菌摇瓶发酵生长曲线的测定为了考察阿维拉霉素产生菌发酵周期极其发酵过程中的变化 制作了发酵生长曲线。由图 可以看出 发酵过程中 先上升后下降 之间升到最高由于阿维拉霉素的合成需要在碱性条件下进行 因此这一阶段对阿维拉霉素的合成比较有利 效价也在大幅度上升。在 之后 开始缓慢下降 这时菌浓接近较低值 说明菌体开始自溶 引起发酵液的 下降。浙江 商人学硕 研究生学位论文由菌浓 时间曲线显示 菌浓上升迅速 此时应为菌体生长的快速生长期 后开始下降菌体开始发生自溶。 绿色产色链霉菌摇瓶培养条件下阿维拉霉素发酵曲线 从图中可以看出氨基氮含量随着发酵时间的延长而不断地上升。由于菌体在发酵初期会产生蛋白酶分解培养基中难利用氮源 用于菌体生长的需要 所以氨基氮含量会相应提高。从发酵液来看 其中的豆粕颗粒随着时间的延长而不断被消耗。但在发酵中后期 氨基氮的含量还在继续上升 这可能是由于随着发酵的进行 还原糖量不断减少 而蛋白酶不断分解的氮源菌体又无法吸收 造成菌体可利用的营养成分不足 菌体开始自溶 因此 氨基氮的量呈现不断上升。还原糖的量在 急剧上升 后上升比较缓慢 达到最高随后开始下降。因为菌体的生长所需的碳源主要是来自还原糖 所以在 之间菌体开始生长时将自身合成的淀粉酶释放到培养基中 使培养基中的淀粉分解为还原糖 以满足生长的需要。 之问菌体处于生长对数期 淀粉酶的释放量虽然加大 但菌体对还原糖的利用程度也提高了 因此还原糖量上升缓慢 并逐渐达到稳定。 菌体生长进入稳定期培养基中的淀粉基本上完全水解 浙江工商大学硕上研究学位论文为还原糖。随着菌体继续对还原糖的利用 还原糖的量开始慢慢减少。当培养到 还原糖量减少到 一般根据生产上的判断 左右时培养摹的营养已算基本耗尽 发酵到达终点。由效价曲线可以看出 效价上升缓慢 因为此阶段是菌体对数生长期 此时以初级代谢为主。 后效价上升迅速 说明菌体开始处于稳定期 主要进行次级代谢 当发酵到 左右效价达到最大值 。随后效价开始急剧下降 菌浓也接近最低值 说明此时菌体所处的环境开始恶化 大部分菌体自溶。因此 考虑到目标产物的产量和提取需要 应在 左右就可停止发酵。所以发酵周期选择在 左右。二、碳源优化微生物细胞中碳素含量相当高 一般占干物质重的 左右。它是工业发酵中使用的主要原材料之一。既是构成菌体细胞和代谢产物的主要元素 又是提供微生物活动中所需能源的原料。如淀粉和各种糖类、脂肪、蛋白质、有机酸、醛类和碳氢化合物 都可以作为碳源。本实验根据原材料的价格以及可能的前体物等选用了可溶性淀粉、乳糖、果糖、葡萄糖、木糖、甘露醇作为碳源 以发酵基本培养基来确定适合该菌生长及合成阿维拉霉素的最佳碳源。淀粉、乳糖、果糖、葡萄糖、木糖、甘露醇的景分别选用 可知可溶性淀粉、木糖、甘露醇对于阿维拉霉素的合成较有利 乳糖、果糖、葡萄糖作为碳源时效价较低。不同浓度的糖源对效价有较大影响 其中 的碳源浓度都具较高的效价。菌 利用可溶性淀粉来生产阿维拉霉素 的淀粉浓度下阿维拉霉素的发酵单位最大 达到 。另外 其次是 的木糖。木糖可异构化为核糖 而核糖是阿维拉霉素分子残基 基团的可能碳骨架来源。文献报道的发酵培养基一般以甘露醇 但甘露醇的原料价格较昂贵。可溶性淀粉易得廉价 因此以可溶性淀粉作为主要碳源。考虑到菌体快速生长的需要 除淀粉外还加入适量小分子糖 用于发酵前期能使菌快速利用 促进菌丝体的生长 缩短停滞期 提高后期的产量。浙江 商人学硕 研究生学位论文 可溶性淀粉乳糖 果糖 葡萄糖 分别表示的浓度。三、氮源优化氮素是构成活细胞的基本物质 是组成蛋白质的主要元素 并且当培养基中碳源不足时 还可作为补充碳源。常用的氮源有蛋白陈、牛肉汤、各种氨基酸、酵母膏、花生饼粉、豆饼粉、硫酸铵、硝酸钠等。本实验采用发酵基本培养基 氮源中分别用 的硝酸钾来替代确定最佳氮源。试验中发现采用豆粕粉这种不容易被菌体利用的氮源进行发酵生产 其阿维霉素的产量高于其它试验所采用的氮源。由图 可知 较优氮源是 的豆粕粉 次优氮源是 的大豆蛋白胨 效价分别为 浙江工商大学硕。研究生学位论文 绿色产色链霉菌菌株发酵不同氮源发酵时的终点效价比较 豆粕粉大豆蛋 硝酸钾为了研究其原因在不改变其它条件情况下 我们把原始发酵培养中的大豆蛋白胨 这种容易利用的氮源去除。发酵结果证明 只采用豆粕粉作为氮源发酵 产生的生物量比较少。因此 豆粕粉为氮源发酵生产 阿维拉霉素产量高的原因可能为 大豆蛋白胨这种容易利用的氮源促进了孢子繁殖和菌体生长 一定菌龄的菌体能够较好利用豆粕粉 菌体附着在豆粕粉细小颗粒上 降低了菌体问的接触几率 使得菌体不能结团 促进了阿维拉霉素的产生。四、响应面法 确定最佳碳氮源组合软件是包括数据的统计分析、运筹等问题的科学计算等大量模块的集成软件系统。 设计法是基于不完全平衡下的试验方法 用最少试验次数尽可能精确地估计主效果因素。响应面分析法 是综合试验分析和数学建模最经济合理的实验设计。它以回归法作为函数恒算工具 通过多项式近似 把因子与试验结果浙江工商大学硕上研究生学位论文 响应值 的关系函数化 以此对因子进行面分析 研究因子与响应值之间、因子与因子之间的相互关系 弥补了以前在微生物培养基优化方面的不足。本实验采用双碳源双氮源来做响应面来确定碳氮源的最佳比例。在培养基的配制中碳氮源的比例是非常重要的因为培养基中碳氮比对微生物生长繁殖和产物合成的影响极为明显。氮源太多 会使菌体生长过于旺盛 偏高 不利于代谢产物的积累 氮源不足 则菌体繁殖量少 从而影响产量。碳源过多 则容易形成较低的 若碳源不足 则易引起菌体衰老和自溶。另外 碳氮比不当还会影响菌体按比例地吸收营养物质 直接影响菌体的生长和产物的形成。以可溶性淀粉、豆粕粉、木糖和大豆蛋白胨为 个试验因子 分别为 。采用二次回归方程常用的中心组合设计原理来设计实验方案。根据单因素试验结果以及经验设计因素的水平值 其因素和水平见表 每个试验重复处理 取其平均值用软件进行分析。表 实验变量的实际浓度及其对应的编码值 参数自由度参数估计标准误值显著性截距 捧场”墙坶浙江工商人学硕上研究生学位论文以发酵单位为响应值可溶性淀粉、豆粕粉、木糖以及大豆蛋白胨为 个自变量 软件对试验数据做响应面分析。表拟合响应面方程的方差分析 可知拟合的二次回归方程式为 离回归标准差。说明回归方程的拟合程度较好。为了检验回归模型的显著性 其结果见表 可以看出方程应变量和全体应变量之间线形关系明显。表中平均偏差平方和为各自的总偏差平方和除以响应的自由度 值则为来源于回归模型及离回归的平均偏差平方和的比值。从 值分布的临界值表可以看出回归方程是十分显著的 用回归方程来描述响应值与全体各因子之间的线形关系是可靠的。从表 的显著性水平可以看出 各因子存在一定的交互作用。利用 软件对回归模型的阿维拉霉素的积累进行优化 、“对阿维拉霉素产量影响较显著表现的曲线较陡 影响则较弱 表现的曲线较平滑。根据程序分析 时有最大产量预测值为 。按比例进行试验论证 结果如下 浙江 商人学硕 研究生学位论文

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